Apoteker.Net – Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan penampilan tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 ?m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal. HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik. Pengembangan penerapan dalam anorganik menjadi mungkin, misalnya dalam bidang kromatografi pertukaran ion di mana telah tersedia di pasar dengan nama dagang ‘Zipax’ resin peliklar, yakni resin yang dihasilkan dalam bentuk saluran tipis pada permukaan manik kaca yang blat (diameter 2050 mikrometer). Manik-manik itu mempunyai permukaan berpori yang tebalnya 2 mikrometer yang berperan sebagai pengikat saluran resin itu (Bassett et. all., 1994).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah metode analisis kimia yang menggunakan chromatograph untuk memisahkan dan mengukur komponen-komponen suatu campuran. HPLC merupakan metode yang sensitif dan akurat untuk menganalisis berbagai macam senyawa, termasuk vitamin C.
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 ?m; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.
Keadaan vitamin C inaktif ini sering terjadi pada proses pemanasan (bila sayur-sayuran dimasak). Di dalam suasana asam vitamin ini lebih stabil daripada dalam basa yang menjadi inaktif (diketogulonic acid) (Prawirokusumo, 1991).
Untuk menganalisis vitamin C dengan metode HPLC, pertama-tama kita perlu mempersiapkan sampel yang akan dianalisis. Sampel dapat berupa makanan atau minuman yang dianggap mengandung vitamin C, atau suatu sediaan obat yang mengandung vitamin C sebagai salah satu komponennya. Kemudian, kita perlu mengekstrak vitamin C dari sampel tersebut dengan cara yang sesuai.
Setelah vitamin C diekstrak, kita perlu membuat larutan standar vitamin C yang akan digunakan sebagai acuan dalam analisis. Larutan standar vitamin C dibuat dengan mengukur berat vitamin C yang dibutuhkan, kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai sampai mendapatkan konsentrasi yang diinginkan.
Selanjutnya, kita dapat memasukkan sampel dan larutan standar vitamin C ke dalam alat HPLC. Alat HPLC terdiri dari pompa, kolom, detektor, dan komputer. Pompa akan memompa sampel dan larutan standar ke dalam kolom yang terisi dengan media pemisah. Media pemisah akan memisahkan komponen-komponen dari sampel dan larutan standar sesuai dengan kecepatan yang berbeda saat melewati kolom. Kemudian, detektor akan mengukur konsentrasi vitamin C dari sampel dan larutan standar yang telah dipisahkan. Hasil dari detektor akan ditampilkan dalam bentuk grafik konsentrasi terhadap waktu yang disebut chromatogram, yang kemudian dapat dianalisis dengan bantuan komputer.
Setelah chromatogram diperoleh, kita dapat menghitung konsentrasi vitamin C dari sampel dengan menggunakan rumus yang sesuai. Rumus tersebut akan menggunakan konsentrasi vitamin C dari larutan standar sebagai acuan dan menghitung konsentrasi vitamin C dari sampel berdasarkan perbandingan antara kedua konsentrasi tersebut. Dengan demikian, kita dapat mengetahui seberapa banyak vitamin C yang terkandung dalam sampel yang telah dianalisis.
*Sumber:
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Prawirokusumo, Soeharto, Prof. Dr. M.Sc., 1991, Biokimia Nutrisi dan Vitamin, BPFE, Yogyakarta.
